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晶诚CrystaroseC FF填料测试报告

发布时间: 2016-08-24

　　1、仪器以及耗材

　　1.1 仪器：JC-1自动化蛋白纯化系统(晶诚)

　　1.2 色谱柱：XK16(GE)

　　1.3晶诚生物科技：CrystaroseC FF(5ml)

　　1.4 GE:Chelating FF(5ml)

　　2、缓冲溶液配制

　　2.1 平衡缓冲溶液：20mM Tris-cl,300mM NaCl,PH8.0

　　2.2 洗脱缓冲溶液1:20mM Tris-cl,300mM NaCl,50mM Imidazole ,PH8.0

　　2.3 洗脱缓冲溶液2:20mM Tris-cl,300mM NaCl,100mM Imidazole ,PH8.0

　　2.4 洗脱缓冲溶液3:20mM Tris-cl,300mM NaCl,250mM Imidazole ,PH8.0

　　2.5 洗脱缓冲溶液4:20mM Tris-cl,300mM NaCl,500mM Imidazole ,PH8.0

　　3、操作步骤：

　　3.1.晶诚CrystaroseC FF填料测试：

　　3.1.1 将色谱柱用去离子水清洗干净后，倒入约5ml左右的CrystaroseC FF.用平衡缓冲溶液平衡层析柱，流速为5ml/min.

　　3.1.2 凝胶完全沉降后，在凝胶的水平面位置用记号笔在层析柱上画一个横线。

　　3.1.3 下压层析柱上调节转换器，使之和填料表面接触即可

　　3.1.4 进样，流速3ml/min,总样品体积为20ml.

　　3.1.5 用平衡缓冲溶液冲洗层析柱直至接近基线平行。

　　3.1.6 洗脱，依次用不同浓度的洗脱缓冲液洗脱，手机洗脱溶液。

　　3.2 GE Chelating FF测试

　　3.2.1、将晶诚的CrystaroseC FF填料全部倒出，拆开层析柱，先用自来水冲洗层析柱的柱管和上下筛网，再用去离子水冲洗层析柱。重新组装层析柱后倒入GE公司的Chelating FF填料。

　　3.2.2、去掉多余的填料，沉降后的填料上表面和柱管表面记号线保持水平位置，用平衡缓冲溶液平衡层析柱。

　　3.2.3、后面的步骤同3.1.3---3.1.6.

　　4、结果分析：

　　4.1 通过对晶诚生物科技生产的CrystaroseC FF和GE公司的产品Chelating FF比较发现，两种填料通过金属螯合亲和层析后均能够得到较高纯度的目的蛋白。但是在色谱图上，CrystaroseC FF的出峰时间较晚，Chelating FF在100mM 浓度的Imidazole洗脱时就有大量的目的蛋白被洗脱，占到总洗脱蛋白的65%,剩下的35%蛋白在250mM浓度的Imidazole被洗脱，在50mM浓度的Imidazole洗杂步骤时也有部分蛋白被洗脱。CrystaroseC FF的洗脱时间普遍偏晚，在10%洗杂步骤只有极少的目的蛋白被洗脱，绝大部分蛋白在250mM 浓度的Imidazole被洗脱，其占到总洗脱蛋白的82%.在100mM和500mM浓度的Imidazole时有少部分蛋白被洗脱。所以，CrystaroseC FF对蛋白的吸附能力较强，保留时间相应增加。这一特性可以大大提高填料的纯化性能。比如纯化一些对Ni柱亲和力较弱的蛋白，普通的Ni柱不结合或者结合很弱，在洗杂时随着杂蛋白一起被洗脱，难以得到有效的分离。如果使用CrystaroseC FF填料纯化的话就有可能会被有效吸附从而得到分离纯化。

　　4.2 两种填料在蛋白收率方面也有区别，CrystaroseC FF总洗脱蛋白为33.9mg,Chelating FF的总洗脱蛋白为29.8mg.在蛋白收率方面CrystaroseC FF的蛋白总收率比Chelating FF高14%左右。分析其原因有两方面，其一，从SDS-PAGE图上可以看到流穿液里都有少部分目的蛋白，其中Chelating FF的流穿蛋白明显比CrystaroseC FF的要多。其二，Chelating FF在洗杂步骤也有部分目的蛋白被洗脱而损失掉(图3).

　　4.3 在色谱图峰型方面，CrystaroseC FF的峰型更尖锐，洗脱峰更好(图1、图2).

　　5 色谱图